四川大学赵长生/赵伟锋《Nat.Biomed.Eng》：水凝胶微球使凝血因子失活，使体外血液净化过程中的血液临时变稀

在体外血液净化过程中，会给予抗凝剂以防止血栓形成。但是，由于患者之间的差异，确定抗凝剂的准确剂量会很复杂，这些患者中抗凝剂的清除率会随疾病状态而变化。接受过量抗凝剂血液净化的患者可能会出现出血性并发症，例如脑出血，严重的胃肠道出血，而抗凝剂给药不足的患者可能会出现与凝血相关的并发症，包括血液中的血栓形成。因此，传统的抗凝剂在血液净化中的使用是一种低安全性的策略，而诸如血液净化后出血风险等关键问题仍未得到满足。为应对这些关键挑战，四川大学赵长生教授和赵伟锋副教授团队提出了一种的血液稀化策略，该方法采用聚合物微球代替体外抗凝药物来结合体外循环中的凝血因子。当放置在药筒中时，这些聚合物微球具有出色的稳定性，并有效结合凝血因子VIII，IX和XI。因此，在体外管和血液透析仪中都防止了血液凝结。在体外循环中，血液被引入新的设备，然后通过血液透析仪或血液灌流设备实现同时的抗凝，内源性毒素清除和液体去除。血友病是由凝血因子（如VIII，IX或XI）不足引起的。因此，我们将此体外血液稀释策略命名为假血友病模型。不同于血友病患者中凝血因子的长期缺乏，假性血友病模型中凝血因子的部分缺乏是暂时的和局部的。纯化后，假血友病血液在重新引入患者体内后迅速恢复至正常状态，从而避免了使用抗凝剂。相关工作以“Transient blood thinning during extracorporeal blood purification via the inactivation of coagulation factors by hydrogel microspheres”为题发表在《Nature Biomedical Engineering》上。

【水凝胶球的设计，理化特性和生物相容性】为了防止水凝胶球体意外暴露于人体中，将球体的尺寸设计在微米范围内，并通过电喷涂制备。在水凝胶三维网络内引入磺酸基，羟基和羧基中，以提供血液稀释属性。为了增加水凝胶的尺寸稳定性，将疏水性聚合物骨架引入到水凝胶网络中。选择聚醚砜作为骨架，同时添加N-乙烯基-2-吡咯烷酮以增强骨架的亲水性，使其能够与血液充分接触。为了探索两种聚合物在水凝胶网络中的最佳比例，制备了具有不同水凝胶网络的各种微球，并通过能量分散光谱，元素分析和X射线光电子能谱进行了表征。进行一系列凝血实验以确定耗尽因子的水凝胶网络的最佳组成。选择了在最低浓度下将凝结时间从5分钟延长到180分钟以上的微球，以进行进一步研究，将其称为增强型抗凝水凝胶微球（RAHMs）。进行了一系列实验以评估RAHM的血液相容性。疏水性聚合物微球（HPMs）显示出比RAHMs高的白蛋白吸附水平，从而表明它们具有良好的血液相容性。通过测量血小板粘附水平和血小板因子4（PF4）的浓度，系统地研究了RAHMs对血小板活化的影响。在全血中孵育RAHM后，PF4的生成浓度与对照组无显着差异。使用溶血实验研究了RAHM的红细胞相容性。以上实验表明，微球对血细胞的影响可忽略不计，因此可以安全地用于治疗。选择人补体片段3a（C3a）和C5a作为代表性的过敏毒素，以评估RAHM对补体激活系统的影响。发现RAHMs不会诱导激肽释放酶-激肽系统的活化，并且在与血液接触时会抑制TAT的产生。此外，还研究了RAHM的抗菌粘附特性，很难观察到明显的细菌粘附在RAHM的表面上，表明RAHM的长期保存是可能的。

球体的设计和生物相容性体外评估【水凝胶微球的血液稀释特性】为了验证RAHM在血液净化方面的潜在适用性，在体外系统验证了它们的血液稀释特性。用不同浓度的RAHM孵育后，研究了凝血酶时间（TT），活化的部分凝血活酶时间（APTT），凝血酶原时间（PT）和血浆中纤维蛋白原的浓度。表明RAHMs对内在凝血途径中的凝血因子具有较强的抑制作用，而HPMs则显示出较弱的血液稀释特性。与凝血因子的活性相比，RAHMs对抗凝血酶活性的作用较弱。证明糖醛酸主链结构和磺酸基团在设计具有肝素样抗凝血酶活性的抗凝聚合物中至关重要。因此，尽管磺化的表面赋予RAHM良好的血液稀释特性，但其相对较弱的肝素样抗凝血酶活性可能是由于缺乏糖醛酸骨架所致。还研究了不同浓度下RAHM的血浆重钙化时间（PRT），并使用血清蛋白电泳，凝血时间测试和快速血栓弹力描记术对正常全血和假血友病血进行比较。与正常全血相比，假血友病血显示出更长的凝血时间，更低的凝血因子活性以及更少的纤维蛋白和血小板聚集，而血清蛋白的分布却保持正常。最后进行了基于质谱的蛋白质组学研究，以鉴定RAHM和HPM上的表面附着/结合凝血蛋白，表明RAHMs的凝血因子耗竭能力是其优异的血液稀释特性的原因。

评估球体的血液稀释特性

【假性血友病模型在体内的疗效和安全性】考虑到RAHMs的高血液相容性，出色的血液稀释能力，低的细胞毒性和抗菌粘附特性，研究人员预期不使用传统抗凝剂同时进行体外抗凝治疗和体内止血功能的快速恢复是可行的。因此，通过将RAHM放入定制设备中来制备血液稀释设备，使用健康的比格犬在体内研究了RAHM的功效和安全性。

假性血友病模型的建立及其体内安全性

【假性血友病模型在体内的功效】研究人员预计通过使用这种假性血友病模型可以实现体外抗凝和体内止血功能的恢复，从而可以避免传统抗凝剂引起的出血风险。因此，在动物实验中，系统地研究了RAHMs的性能，并将其与临床上最常用的抗凝剂肝素作为对照组进行比较。在治疗过程中，治疗结束后0、30、60和120分钟以及治疗结束后120分钟采集的血样经过不同的凝血时间测试。肝素治疗组和RAHM治疗组之间PT的延长无差异。但是，对于APTT和TT，两组均显示出明显的延长。对于RAHM治疗组，随着治疗的进行，延长时间逐渐减少，并在治疗结束后120分钟恢复到初始水平，而对于肝素治疗组，在整个实验过程中血液仍保持抗凝状态。假性血友病模型可以迅速恢复止血功能。以上结果表明，假性血友病模型在维持整个体外循环的通畅性方面显示出显着的能力。但是，在临床中，血液透析需要使用透析液去除毒素。因此，用透析液流进行了血液透析治疗，以研究假血友病模型在临床情况下的性能。类似于没有透析液的治疗，RAHM在治疗期间仍显示APTT和TT的相当长的延长，这足以确保通过RAHM成功地应用血液稀释。APTT和TT值无显着差异，这表明透析液对RAHMs的血液稀释特性影响很小，因为凝血因子在通过透析器之前已经被消耗掉了。结合假血友病模型的血液稀释特性和止血功能的恢复，研究人员认为在血液透析临床中可以实现更安全，更理想的血液稀释策略。研究人员还研究了使用较小透析器进行血液透析的假血友病模型的行为，该透析器可能更适合狗。

假性血友病模型在体内的功效

假血友病模型在血液透析中的实际应用

总结这项工作显示了在体外和在比格犬中，吸附凝血因子VIII，IX和XI的水凝胶微球在血液净化之前放置在体外回路中时会提供临时的血液稀释。微球抑制凝血因子活性的水平类似于轻度血友病中发生的水平。在将其重新引入动物时，纯化的假血友病血液有利于止血的更快恢复。临时的稀血策略可以提高临床血液净化程序的安全性，避免出血的风险。并开发了并入RAHM设备还可以帮助使整个血液净化设备小型化，并减少操作步骤。但是，为了使患者能够接受，该设备必须轻巧且符合人体工程学，通过用本工作中介绍的血液稀释设备代替肝素泵可以达到这些要求。假性血友病模型出血风险的降低比传统的抗凝策略更有利于持续治疗，可以指导未来用于患者护理的血液净化设备的重新设计。