Nano Letters：可注射水凝胶微球能够调节局部过度活跃性炎症反应

炎症是指身体对刺激的机械、生化或免疫介导的适应性反应。然而，过度活跃性炎症反应是有害的，长时间的炎症过程不仅会干扰受损组织的修复过程，还会引发一系列级联反应，这些级联反应与炎症细胞持续募集到病变附近并形成局部炎症细胞因子风暴有关，这两种情况最终都会阻碍组织修复并加剧退变。可注射水凝胶微球具有延长药物半衰期，保持局部药物有效浓度等优点，已在临床药物载体应用中表现出了巨大的潜力，但退行性疾病中的局部过度活跃性炎症可能会影响这一治疗效果。

近期，来自苏州大学第一附属医院的陈亮教授、顾勇教授与上海交通大学医学院附属瑞金医院的崔文国教授团队合作在Nano Letters杂志上发表了题目为“Modulation of Local Overactive Inflammation via Injectable Hydrogel Microspheres ”的研究性论文，作者通过在甲基丙烯酰化明胶（GelMA）上共价偶联APETx2并进一步负载髓核细胞来构建可注射的“肽-细胞-水凝胶”微球，既能抑制局部炎性细胞因子风暴，又实现了在体外调节细胞外基质（ECM）的代谢平衡，为过度活跃性炎症反应下的组织修复与再生提供了一种有效的途径。

图1 文章原理图，在GelMA上偶联APETx2并进一步负载髓核细胞来构建可注射的“肽-细胞-水凝胶”微球，该微球可抑制局部过度活跃性炎症并维持ECM稳定。

微流控技术是构建水凝胶微球的理想平台。它不仅可以同时装载药物和细胞，而且操作简便，通过与活性肽APETx2共价偶联并进一步携带髓核细胞，即可构建出“肽-细胞-水凝胶”凝胶微球。如图2所示.：通过微流控同步光交联装置制备GelMA微球（GM）后清洗并冷冻干燥后制备出多孔GelMA微球；制备APETx2共轭多孔GelMA微球(GA)并负载髓核细胞，在椎间盘（IVD）退变的大鼠模型中注射“肽-细胞-水凝胶”微球(GNA)；“肽-细胞-水凝胶”微球调节了大鼠IVD退变部位的过度活跃性炎症，并促进髓核细胞增殖与IVD的再生。

图2 可注射“肽-细胞-水凝胶”微球调节局部过度活跃性炎症来促进椎间盘再生的示意图。

凝胶微球通过微流控装置中的油包水方法形成，并进一步光交联和冷冻干燥以获得多孔凝胶微球。如视频1所示，在显微镜下观察，同轴喷嘴同向剪切制备的凝胶微球分散性好，大小均匀，微球可以顺利地穿过微型注射器的针头，而不会损坏结构。

视频1 微球顺利通过微型注射器的针头，没有损坏结构。

为了赋予髓核细胞调节局部过度活跃性炎症反应的能力，微球表面的羧基被EDC/NHS激活，然后共价连接到APETx2上的氨基残基上，形成APETx2-GelMA微球（即GA）。接下来，通过图3的XPS分析和傅里叶变换红外光谱分析，表明APETx2肽接枝成功且SEM表明GA保留了GM的多孔结构。糖酵解是椎间盘能量供应的主要形式，逐渐积累的乳酸在退行性椎间盘中产生酸性微环境。因此，研究人员通过高效液相色谱法研究了在两种酸碱度条件下(7.4和6.5)赤霉素的释放行为，在pH 6.5条件下肽的释放速率比pH 7.4条件下高，但两者之间无显著差异。

图3 可注射“肽-细胞-水凝胶”微球（GNA）相关的表征。（A、B）SEM观察GM与GA微球的微观形貌差异；（C-F）GM与GA微球的XPS分析与傅里叶变换红外光谱；（G-H）微球接枝FITC-BSA前后的荧光图像,以及在pH7.4和pH6.5下，GA释放APETx2的释放曲线。

此外，在体外酸性环境中，研究人员检测了相关蛋白和基因的表达水平。如图4所示，谷氨酸组的ASIC-3蛋白表达受到显著抑制，与对照组无显著差异。炎症细胞因子白介素-1β、白介素-6和肿瘤坏死因子-α，也被APETx2显著抑制。与此同时，APETx2下调MMP-3和ADAMATS-5的表达，从而减少由NPCs合成的细胞外基质的降解，导致细胞外基质含量的增加，COL2和聚集蛋白聚糖蛋白的高表达也证明了这一点。以上结果表明，APETx2可以抑制ASIC-3的激活，减少酸性环境引起的椎间盘炎性细胞因子风暴。此外，APETx2可逆转酸性环境下髓核细胞内细胞外基质的合成/分解代谢失衡，导致髓核细胞内细胞外基质沉积增加，抑制椎间盘退变。

图4 髓核细胞在体外酸性炎症微环境中7天的蛋白和基因的表达。（A）ASIC-3、炎症因子、细胞外基质降解酶和细胞外基质蛋白的蛋白质印迹。（B-I）RT-PCR半定量测定ASIC-3、炎症因子、细胞外基质降解酶的基因表达。

为了研究GNA促进IVD体内再生的作用，研究人员将将富含髓核细胞的GA (GNA)注射到大鼠IVD退变模型中。如图5影像学结果表明，调节局部炎性微环境或单独补充髓核细胞可以延缓椎间盘退变，但不能逆转退变的椎间盘。另一方面，“肽-细胞-水凝胶”微球不仅保持和恢复了髓核细胞中的高含水量，而且在延缓退变过程的同时促进了退变椎间盘的再生。

图5 动物实验的影像学数据。(A)大鼠尾椎穿刺模型的建立。(B)第4周和第8周大鼠尾椎骨的代表性x光图像。（C-E)第4周和第8周各组DHI百分率的变化。(F)大鼠尾椎骨的代表性核磁共振图像。(G)各组在第4周和第8周的磁共振分级变化。

术后4周和8周收集组织切片做进一步分析，结果如图6所示：与正常对照组相比，苏木精伊红和番红O-Fast Green染色显示GNA组椎间盘组织变性和结构性损伤有所改善。此外，在髓核和纤维环之间有清晰和明确的边界，并且髓核的含量在8周时显著改善。然而，在DC、GA和GN组中，椎间盘的髓核随着椎间盘突出而逐渐破裂,髓核和纤维环之间的边界越来越模糊。这些结果与免疫组织化学染色的进一步研究结果一致。GNA组的COL2含量在第8周完全恢复，而组织学评分显示GNA组的胶原含量在第4周显著高于DC、GA和GN组，但低于正常对照组。GNA组胶原含量在第8周恢复，与正常对照组无显著性差异，表明“肽-细胞-水凝胶”微球具有促进退变椎间盘再生的作用。

图6 动物实验的组织学评价。(A)4周和8周大鼠椎间盘的苏木精-伊红染色图像。(B)番红O-固绿染色。(D-F)COL2免疫组织化学染色。各组第4周和第8周组织学分级的变化。

综上所述，该研究通过微流控技术制备了与APETx2共价接枝并携带髓核细胞的多孔“肽-细胞-水凝胶”微球，并证实了这种新的“肽-细胞-水凝胶”微球除了参与组织再生过程，还可以调节局部过度活跃性性炎症反应，以维持椎间盘髓核中细胞外基质的合成/分解代谢平衡。这种可注射的“肽-细胞-水凝胶”微球为实现局部过度活跃性性炎症反应微环境下的组织再生提供了新的思路。