Advanced Science ：基于缠结微束型水凝胶的3D生物打印

基于挤出式的3D生物打印技术已经被广泛应用于创建多种功能组织类似结构体，包括心肌、骨骼肌、肝脏、皮肤、骨骼和软骨等。通常，生物墨水是由水凝胶前驱体制备得来的。通过改变水凝胶前驱体的流变特性，使得生物墨水在挤出时可作为连续的凝胶细丝沉积在支撑平台上。与液体生物墨水相比，微凝胶生物墨水被认为是一种新兴的生物墨水，这种生物墨水具有固有的剪切变稀和剪切恢复特性。同时，由于微凝胶之间存在内在空隙，与块体凝胶材料相比，微凝胶生物墨水中的细胞具有更高的生存能力、扩散和迁移能力。

近期，苏黎世大学健康科学与技术系MarcyZenobi-Wong教授团队将块状水凝胶挤压通过微米大小孔径的网格，将水凝胶分解成微束型凝胶网络。软骨细胞与凝胶微束的共沉积3D生物打印形成的凝胶支架可诱导软骨细胞形成丰富的细胞外基质，使其压缩模量得到显著地提升。该研究中微束型水凝胶的构建策略为3D打印生物墨水提供了一种新型的制备手段。相关研究论文：“3D Bioprinting of Macroporous Materials Based on Entangled Hydrogel Microstrands”发表于Advanced Science上。

图1 缠结微束型凝胶网络的构建及3D生物打印示意图

凝胶材料：

甲基丙烯酰化透明质酸（HA-MA）、甲基丙烯酰化明胶（GelMA）、明胶

工艺：

UV交联HA-MA（浓度2%w/v，接枝率28%）或GelMA（浓度2%w/v，接枝率92%）/明胶块体水凝胶通过孔洞为40~100μm的筛子进行机械挤压。这一过程将凝胶块体分解成凝胶微束，这些微束随机地相互缠绕，组成一种高纵横比水凝胶组成的结构化材料。

1. 缠结微束型凝胶的稳定性和宏观孔隙率：

为了研究3D打印缠结微束型凝胶的可调性，研究者通过调整UV交联时间（20s、60s、180s）制备了一系列不同交联强度的HA-MA体系凝胶。对比颗粒水凝胶，37℃下浸泡于PBS 7天中，块体微凝胶在1h内瓦解掉，而缠结微束型水凝胶在水介质中具有长期的凝聚力。为了评估HA-MA缠结微束型凝胶的孔隙率，研究者将凝胶浸入高分子量葡聚糖荧光染料中。由于葡聚糖的分子量较大，图2H显示出荧光标记的葡聚糖只能进入凝胶束之间，而无法穿透水凝胶的凝胶相，基于此，研究者可用来计算凝胶的孔隙率（图2）。

图2 缠结微束型凝胶网络的稳定性和宏观孔隙率

2. HA-MA缠结微束型凝胶的剪切变稀及剪切恢复特性：

缠结微束型凝胶表现出剪切变稀的流变学特性，这是挤出式3D生物打印所必需的。通过流变学测定，不同交联强度的HA-MA微束型凝胶的剪切恢复率不同，且随着筛网孔径的不同而改变，通过比对，研究者指出中等交联强度的缠结微束型凝胶样在初始剪切后的剪切恢复率为81.8% (筛网孔径40 μm)和82% (筛网孔径100 μm)，明显优于其他两组，可作为优良的3D打印生物墨水（图3）。

图3 HA-MA缠结微束型凝胶网络的流变特性

3. 缠结微束型凝胶的3D打印特性：

基于HA-MA微束型凝胶，研究者3D生物打印出两层网格结构。交联率越高的凝胶样品在较短的拉伸距离下越易断裂，印刷精度也就越高。此外，考虑到缠结微束型水凝胶的流变学特性，中等交联强度的缠结微束型凝胶样是最优良的生物墨水。两种孔径尺寸（40μm和100 μm）的流变性能和印刷性能没有明显差异，但孔径尺寸对空隙率有显著影响，因此可以根据实际应用选择该参数来调整凝胶的宏观孔隙率。另外研究者还测试了其他水凝胶体系（GelMA、卡拉胶及酶或化学交联的HA等），经预交联过滤形成微束型凝胶后，再进行挤出式3D生物打印。测试结果表明所有的凝胶体系均可形成缠结的微丝并3D打印出网格支架。

图4 缠结微束型凝胶的挤出式3D可打印性和各向异性

4. 负载细胞的缠结微束型凝胶的3D生物打印：

研究者分别采用两种方法探究缠结微束型凝胶的负载细胞能力：方法一，首先，细胞被嵌入到块体水凝胶中，然后水凝胶被挤压成凝胶微束；方法二，被挤压成型的凝胶微束与细胞悬液混合，使细胞占据微束间的孔隙。采用方法一，研究者选择明胶复合GelMA水凝胶探究缠结微束型凝胶负载小鼠成肌细胞（C2C12）的能力，钙黄素AM染色结合Hoechst 染色显示细胞融合并形成沿微丝方向排列的多核肌管（图5）。采用方法二，研究者选择HA-MA水凝胶微束和软骨细胞复合，结果显示软骨细胞在3D生物打印后表现为圆形表型，但在培养7天和21天后增殖并显示出更长的梭型（图6）。

图5 缠结微束型凝胶可诱导成肌细胞的肌管形成

图6 缠结微束型凝胶负载软骨细胞的高细胞活性3D打印

5. 体外负载软骨细胞的缠结微束型凝胶诱导软骨再生：

负载软骨细胞的HA-MA缠结微束型凝胶培养42天后，凝胶块呈白色软骨状，表明了致密的细胞外基质沉积。为了证实这一点，研究者对培养的组织结构进行软骨特异性标志物染色，染色结果表明相关的蛋白多糖、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原均得到高表达，其中Ⅱ型胶原在42天后，胶原染色增强，表现为微束内沉积及水凝胶网络中的沉积。随后，研究者对比了3D打印凝胶微束负载软骨细胞培养21天及42天前后的压缩模量，其模量由2.7 ± 0.3 kPa增加至212 ± 83.7 kPa，后增加至780.2 ± 218.4 kPa。虽然此机械强度远不及原生软骨组织的压缩模量（1829.8 ± 72 kPa），但仍是一个显著的进步。由于本研究中使用的材料本身的抗压缩能力很小，压缩模量的变化完全可以归因于细胞外基质的大量沉积和成熟（图7）。

图7 缠结微束型凝胶诱导软骨再生

6. 总结：

该研究以高纵横比水凝胶微束为生物墨水，该生物墨水中的凝胶微束相互缠结形成多孔且稳定的凝胶网络。且该缠结微束型凝胶能够促进成肌细胞的肌管形成，并维持相对较高的细胞活性（90%）。软骨细胞与凝胶微束共沉积打印形成的凝胶支架可诱导软骨细胞形成丰富的细胞外基质，使其压缩模量得到显著地提升。该研究中微束型水凝胶的构建策略为3D打印生物墨水提供了一种新型的制备手段。

论文链接：

https://doi.org/10.1002/advs.202001419