被肾脏清除的、具有催化活性的金纳米团簇用于疾病检测

通过手术和放射治疗等局部治疗措施可进行早期癌症诊断，从而使有效治疗原发性肿瘤成为可能。早期诊断主要依靠血液生物标记物，然而，大多数生物标记物因从肿瘤中脱落的速度非常低，且被血液循环严重稀释以及缺乏特异性等问题阻碍了早期检测的准确性和灵敏度。值得注意的是，大多数人类的非传染性疾病（如癌症、炎症和血栓形成）会对蛋白酶活性产生影响，若将检测蛋白酶活性作为疾病的生物标志物，则有助于避免灵敏度和特异性不足等缺陷，但是检测蛋白酶活性的工具通常需要依赖于繁琐的基础设施分析，如荧光、质谱或磁共振成像，这些技术在实践中需要昂贵的分析试剂，且在不同的环境中通用性较差。因此，为了实现精准医疗在全球范围内的普及，就需要开发简单、灵敏度高的诊断工具来检测蛋白酶活性。

为了满足简单、灵敏诊断读数的需要，超小金纳米团簇（AuNCs，<2 nm）不仅具有分立的电子和分子性质，而且具有类过氧化物酶活性，可以提供催化活性的比色测量。然而，迄今为止，AuNCs仅用于荧光和X射线对比生物成像的活体应用，因此，利用AuNCs的催化活性来开发一个能直接用比色法读出疾病状态的纳米传感器显得尤为重要。

基于此，麻省理工学院Sangeeta N. Bhatia教授和伦敦帝国理工学院Molly M. Stevens教授合作，以生物素化蛋白酶裂解肽为模板，并与中性亲和素（NAv，生物相容性载体，对生物素具有高亲和力和低特异性的结合性能）偶联，进而构建了一种多功能蛋白酶响应性纳米传感器。当经尾静脉注射到结肠癌小鼠体内后，可被肿瘤部位的锌依赖性基质蛋白酶9（MMP9）特异性切割，导致纳米传感器组装体解体，然后AuNCs（2 nm）经肾脏滤入尿液中。由于AuNCs具有拟过氧化物酶活性，其在过氧化氢的存在下可以使TMB产生明显的显色反应，从而可以通过肉眼判定肿瘤的有无以及严重情况（图1）。

图1 纳米催化剂信号放大传感系统的设计

作者使用三肽谷胱甘肽（GSH, γ-Glu–Cys–Gly）、巯基功能性蛋白酶可裂解肽（P1₁₃/P1₂₀/P2₁₃/P2₂₀（表1））、次氯金酸（HAuCl₄）一锅法合成了四种多肽功能化的AuNCs（图2a）。透射电子显微镜（TEM）观察到所得GSH-AuNCs平均粒径为1.5±0.4 nm，低于肾小球滤过极限（~5.5 nm），说明所得纳米团簇可能很容易被肾脏清除（图2b、c）。通过在652 nm处测量底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺（TMB）的吸光度值（A₆₅₂） 来反应多肽功能化的AuNCs的拟过氧化物酶活性（图2d）。为了评估催化探针的灵敏度，作者测量了不同浓度多肽功能化的AuNCs在合成尿液中的催化活性（图2e），结果显示，检测限（LOD）为~2.7 pmol （尿液25 µl，~100 nM AuNCs），并且线性响应范围宽，动态范围超过三个数量级的颗粒浓度。由于天然辣根过氧化物酶在体内容易受到内源性蛋白酶的非特异性降解进而阻碍其催化活性，然而，GSH-AuNCs和P2₂₀-AuNCs在生理环境中表现出高度的稳定性，同时，在血清和尿液中能保持很高的催化活性（图2f）。

图2 多肽功能化的AuNCs具有很高的催化活性

为了确定肾脏清除颗粒的效率，作者通过催化活性分析和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）对注射多肽功能化的AuNCs小鼠尿液中的金含量进行测定（图3a）。结果表明，在注射1 h后，尿液中含有73±7%多肽功能化的AuNCs且具有较高的催化活性（图3b），并且，催化活性和ICP-MS的结果呈正相关（图3c）。因此，利用催化活性的比色活性测定法可以简单而灵敏地评估尿液中AuNCs的存在，而不需要ICP-MS。

图3 多肽功能化的AuNCs可被肾脏清除，并在

尿液中保持较高的催化活性

随后，作者采用荧光相关光谱（FCS）作为单分子检测的方法来探究AuNC-NAv复合物的蛋白裂解动力学过程（图4a）。当复合物与MMP9孵育后，观察到复合物的扩散系数随着时间推移向游离荧光标记簇的扩散系数移动，这表明复合物已经解体（图4b）。另外，FCS的流体力学尺寸分析表明，AuNC-P2₂₀-NAv复合物与MMP9孵育后在4.5 h内完全解体，而当与非靶标酶——凝血酶（THR）孵育12 h时，AuNC-P2₂₀-NAv复合物的大小并没有下降到肾小球滤过极限以下（图4c），此外，MMP9对AuNC-P2₂₀-NAv复合物每分钟的切割速率（3%）是AuNC-P2₁₃-NAv复合物（0.08%）的40倍，这可能归咎于P2₂₀肽链较长，使得酶对剪切键的可及性增加。同时，在第1 h内，约80%的AuNC-P2₂₀-NAv复合物被MMP9孵育切割（图4d）。综上所述，本文所设计的蛋白酶响应性纳米传感器对目标酶具有特异性，且在目标酶的作用下裂解速率很快。

图4 体外验证AuNC-NAv复合物与蛋白酶

孵育后的裂解过程

在体内结肠癌检测实验中，荷瘤和健康小鼠均通过尾静脉注射MMP9响应性AuNC-P2₂₀-NAv复合物（图5a）。通过直接比色读数和收集尿液中清除的AuNC催化活性的初始速度分析（A₆₅₂ min^-1），1h后收集小鼠尿液样本进行催化活性检测发现：与健康小鼠相比，荷瘤小鼠的尿液样本可使底物TMB具有肉眼可见的蓝色（图5b），携带肿瘤的小鼠平均尿信号比健康小鼠增加了约13倍（图5c）。此外，受试者工作特性分析显示，曲线下面积为0.91 （图5d，P=0.0002），说明该比色实验可区分结直肠癌异种移植瘤的存在且准确度高。为了验证AuNC-NAv复合物在体内解体不是因为自身化学稳定性差或非特异性切割，作者将THR响应性的AuNC-P1₂₀-NAv复合物注射到荷瘤和健康小鼠体内，结果表明，与健康小鼠相比，荷瘤小鼠的尿液样本中没有产生任何显著的比色信号（图5e）。因此，AuNC-NAv纳米传感器仅对体内疾病的特异性蛋白裂解活动做出反应，并能够通过比色直接读出疾病状态。

图5 蛋白酶响应性纳米传感器通过比色尿

直接读出疾病状态

总之，作者开发了一种通过比色尿来检测疾病状态的方法，该方法快速、简单、灵敏度高、特异性强。所设计的响应性纳米传感器可用于快速检测各种与疾病相关的蛋白酶，包括那些与传染病有关的酶，从而使人们快速、准确的获得诊断信息。

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