单原子纳米酶分析化学

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纳米酶是指具有类酶活性的纳米材料。自2007年阎锡蕴院士发现磁性四氧化三铁纳米颗粒具有本质的过氧化物酶活性之后，¹学者们陆续发现了贵金属、过渡金属和碳材料等纳米材料的类酶特性，并且将其广泛应用于生物医学分析等领域。^{2, 3}复杂的结构和原子组成赋予纳米材料催化位点和催化机理的多样性，这对我们理解其构效关系和催化本质带来了巨大挑战。为了进一步提高纳米酶的催化活性，深入理解其催化机理和本质，研究者发现单原子催化剂，特别是M-N-C型单原子催化剂，具有与天然金属酶相似的活性中心，因此可以模拟酶的催化活性，这种催化剂被称之为单原子纳米酶。^4-6对比传统的纳米酶，单原子纳米酶具有原子级分散的活性位点、100%的原子利用效率、可调控的配位环境等优势，这些赋予了单原子纳米酶优异的催化性能，更有利于从原子尺度下理解纳米酶的催化本质，为设计高效的纳米酶提供理论基础。

本文主要介绍华中师范大学朱成周教授课题组在单原子纳米酶领域的研究成果。

Fe-N-C单原子纳米酶设计并应用于细胞内过氧化氢检测

图1. 细胞内过氧化氢检测的示意图⁷

作者利用葡萄糖分子上丰富的羟基螯合铁离子，可以避免金属离子的团聚。通过双氰胺提供氮源来锚定铁原子，采用一步退火方法合成了以FeN₄为活性中心的二维Fe-N-C单原子纳米酶。Fe-N-C单原子纳米酶的活性中心与天然的辣根过氧化物酶相似，因此可以表现出优异的过氧化物酶活性。⁷

过氧化氢在生物体内发挥重要的作用，是很多生化反应的产物。过氧化氢会分解产生大量活性氧进而造成氧化损伤，对生命体具有较大的毒害作用，例如过量的ROS会导致细胞发生癌变，诱发心血管疾病等。因此，过氧化氢的灵敏性检测在生化分析和临床诊断中具有重要意义。本工作中利用PMA刺激Hela细胞产生的过氧化氢可以被Fe-N-C单原子纳米酶捕获，进一步被分解为具有强氧化能力的羟基自由基，可以氧化底物TMB变色。由此实现了对细胞内过氧化氢的灵敏性检测（图1）

高负载量二维M-N-C单原子纳米酶优化设计及细胞内过氧化氢检测

图2. 高负载量Fe-N-C单原子纳米酶的制备过程及结构表征⁸

上述工作是作者在单原子纳米酶领域的初步探索，但是M-N-C单原子纳米酶的催化机理尚不明确，并且金属原子负载量比较低，导致活性位点数目较少。近期，作者采用一种通用的盐模板策略制备了二维超薄M-N-C（M=Fe，Co和Zn）单原子纳米酶。⁸表征结果显示该催化剂具有二维超薄的纳米片结构，其中Fe-N-C厚度约为1.8 nm，可以提高金属原子的负载量和暴露量。球差电镜和X射线吸收的结果表明该催化剂中金属以单原子形式分布在催化剂表面。ICP-OES测试结果发现该Fe-N-C单原子催化剂中有13.5 wt%的Fe原子，远远超过目前报道的Fe-N-C单原子催化剂。

作者通过利用TMB作为底物研究了Fe (Co, Zn)-N-C单原子纳米酶的过氧化物酶活性，发现Fe-N-C单原子纳米酶的比活性是25.33 U/mg远远超过Co-N-C (6.33 U/mg)和Zn-N-C (2.46 U/mg)。利用KSCN和异丙醇作为探针分子，结合电子自旋共振技术，作者发现Fe单原子是催化的活性位点，活性中间产物是羟基自由基。通过对比发现，该方法制备的Fe-N-C单原子纳米酶（负载量13.5 wt%）的催化活性远远超过作者之前发表的工作中的单原子纳米酶（负载量 1.3 wt%）活性。

图3. M-N-C单原子纳米酶催化机理研究⁸

结合上述实验结果，作者通过理论计算研究了M-N-C (M=Fe, Co, Zn)单原子纳米酶的催化机理。过氧化氢分子吸附到金属原子表面后均裂成两个OH*，其中一个OH*游离出来形成羟基自由基作为活性中间产物，另外一个OH*结合H⁺形成H₂O，进一步从金属原子表面脱附，催化剂返回初始状态。作者发现羟基自由基的形成步骤为速度决定步骤，Fe-N-C单原子纳米酶的能垒最小（1.58 eV），并且其对过氧化氢具有最大的吸附能（-0.45 eV）。进一步结合理论计算，作者发现OH*和Fe原子之间的电子转移最少，使得羟基自由基更容易游离出来，因此Fe-N-C单原子纳米酶具有最高的过氧化物酶活性。

借助于所合成Fe-N-C单原子纳米酶优异的过氧化物酶活性，作者将其应用于细胞内过氧化氢的高灵敏检测。该工作深入研究了M-N-C单原子纳米酶的过氧化物酶催化机理，为设计高效的单原子纳米酶提供了实验和理论支撑。

分级多孔结构的Fe-N-C单原子纳米酶模拟氧化酶及在乙酰胆碱酯酶活性评价中应用

催化剂的设计制备都遵循两个基本的原则，即提高催化剂活性位点的数目以及活性位点的本征活性。如何在单原子的尺度下构筑单原子催化剂并同时实现这两个基本原则是非常重要的科学问题。围绕着这个出发点，作者采用双模板法构筑分级多孔结构具有FeN₂活性位点的Fe-N-C单原子纳米酶体系。⁹具体来说，以硅球和锌盐为模板，葡萄糖胺为碳和氮的前驱体，在铁盐存在的条件下高温处理，然后酸刻蚀得到最终产物。值得一提的是，Zn盐的加入一方面可以有效地防止Fe原子的聚集，进一步增加单原子的数目；另一方面，高温条件下，Zn的挥发也可以生成大量的孔隙结构，增加碳材料的比表面积，与硅球所生成的介孔构筑分级多孔结构。

实验证明了该Fe-N-C单原子纳米酶具有优异的类氧化酶活性。通过将氧气活化为活性氧物质——超氧自由基（O₂^-•），进而能够催化底物分子的变色反应。作者通过XPS和傅里叶红外分析发现巯基分子可以与Fe-N-C单原子纳米酶结合，从而抑制其氧化酶活性。在有机磷农药（OPs）接触的生物监测中，胆碱酯酶活性已被广泛用作有机磷农药生物标志物，判断生物体受到危害的程度。乙酰胆碱酯酶（AChE）催化硫代乙酰胆碱产生的巯基胆碱同样能够抑制Fe-N-C单原子纳米酶的氧化酶活性，由此实现了AChE的活性检测。OPs能够特异性地抑制AChE的活性，基于此也可以实现OPs的灵敏性检测。

图4. Fe-N-C单原子纳米酶用于乙酰胆碱酯酶活性评价⁹

高负载量二维Cu-N-C单原子纳米酶单原子纳米酶的串联反应系统检测有机磷农药

本工作提出了一种盐模板的方法用于合成高负载量的Cu-N-C单原子纳米酶。¹⁰该Cu-N-C单原子纳米酶具有5.1 wt%的金属负载量，丰富的活性位点能够有效地进一步增强纳米酶的活性，而且超薄纳米片结构对活性位点的实际暴露量有提高作用。同时，基于铜的单原子纳米酶表现出较好的类过氧化物酶活性的同时，其类氧化酶活性表现较差，这说明Cu-N-C单原子纳米酶的特异性有所提高。利用这两点优势，作者构建了Cu-N-C单原子纳米酶与自然的AChE和胆碱氧化酶（ChOx）的串联反应系统并应用于生物小分子乙酰胆碱（ACh）的灵敏检测。基于OPs对AChE的活性的特异性抑制，该串联反应系统进一步应用于有机磷农药（OP）的检测之中。

图5. 串联反应检测ACh和OPs¹⁰

经过十多年的快速发展，纳米酶已成为生化分析检测领域的研究热点并取得令人瞩目的成果。将单原子催化的概念引入纳米酶领域不仅有助于设计合成一系列高性能的纳米酶，也有助于从原子角度理解纳米酶的催化本质，为纳米酶的设计和活性调控提供理论支持。尽管目前单原子纳米酶在生物传感、有机污染物降解和生物治疗等领域已经取得了很大的进步，但是仍然面临一系列的机遇和挑战。¹¹

图6. 纳米酶与单原子催化剂¹¹

从催化剂的合成角度来看，设计合成高负载量、高暴露量的纳米酶体系依然是实现单原子纳米酶广泛应用的前提条件；在表征方面，发展原位、实时、动态的先进表征技术手段是单原子纳米酶研究的根本保证；精确调控配位环境及电子和几何结构并提高催化的活性和选择性是单原子纳米酶研究的关键性问题，目前单原子纳米酶的催化活性以及选择性较自然酶还有比较大的差距；借助于单原子催化领域的最新研究成果来揭示单原子纳米酶结构与催化特性之间的内在联系并在原子尺度下深入探索纳米酶的催化本质是目前纳米酶研究的重要方向；此外，进一步拓展单原子纳米酶类酶种类以及其应用领域也是目前研究的重点。随着研究的深入，相信单原子纳米酶的会展现出更大的应用潜力。

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