DNA 条码系统实现了线粒体靶向金纳米颗粒的高通量体内筛选。三十种形状、大小和配体各异的纳米颗粒类型被单独条码并合并。将合并的文库应用于肿瘤携带小鼠，并放大和测序从肿瘤线粒体检索的条形码，以量化每个纳米颗粒的相对富集情况。

该研究以题为“High-Throughput In Vivo Subcellular Analysis of GoldNanoparticles for Tumor Mitochondrial Targeting”发表在Advanced Materials上。

用于线粒体靶向筛选的条形码金纳米颗粒示意图

（1）不同类型金纳米颗粒经TPP修饰以实现线粒体靶向。对于体外文库，将12种纳米颗粒混合，包括三种形状（球状、棒状、三角形）、两种尺寸（40/80 nm），以及有无TPP修饰。对于体内文库，TPP修饰的纳米颗粒进一步功能化靶向配体以增强肿瘤蓄积。该文库包含30种纳米颗粒，涵盖五种形状（球状、棒状、三角形、立方体、双锥体）、两种尺寸（40/80 nm）和三种靶向配体（FA、HA、RGD）。每种类型分别用特定的DNA条形码标记，然后混合形成混合文库。（2）首先在细胞中测试体外文库，以确认条形码系统的稳健性。（3）将混合的体内纳米颗粒文库注射到荷瘤小鼠体内，（4）从肿瘤线粒体中提取DNA条形码，（5）进行扩增，随后（6）测序以分析相对频率。使用BioRender.com创建。

图2

用于肿瘤线粒体靶向的稳健DNA条形码金纳米颗粒

（A）生理条件下条形码修饰稳定性的评估。将五种不同的纳米颗粒与4T1细胞孵育24小时后，细胞线粒体中DNA条形码的标准化计数。对于“无振荡”条件，纳米颗粒混合后直接加入细胞；对于“振荡”条件，纳米颗粒混合后在37°C下振荡24小时后再加入细胞。（B）4T1细胞线粒体中条形码的标准化计数。均值 ± SD，n = 3。（C）通过qPCR定量线粒体中条形码的拷贝数。*p < 0.05，t检验。均值 ± SD，n = 4。（D）与AuNPL-TPP或AuNRS-TPP孵育后的4T1细胞荧光图像。白线表示用于分析红色（纳米颗粒）和绿色（线粒体）荧光重叠的位置。比例尺为10 µm。（E）不同配方处理细胞后ATP6 mRNA的相对表达量。*p < 0.05，单因素方差分析。（F）不同处理后经JC-1探针染色的4T1细胞荧光图像。比例尺为100 µm。（G）不同配方处理后细胞凋亡的流式细胞术分析。p < 0.0001，单因素方差分析。（H）不同配方处理后的细胞活力。p < 0.0001，单因素方差分析。均值 ± SD，n = 3。

总结

这项研究开发了一套DNA条形码筛选系统，用来快速找出哪种金纳米颗粒最擅长跑到肿瘤细胞的线粒体里去。研究人员把30种不同形状（球、棒、三角、立方、双锥）、两种尺寸（40和80 nm）以及三种靶向配体（FA、HA、RGD）的金纳米颗粒分别贴上不同的DNA条形码，混合后注射到荷瘤小鼠体内。24小时后提取肿瘤线粒体中的条形码并测序，就能一次性评估所有纳米颗粒的线粒体靶向效率。结果发现，80 nm的立方体（CL-FA）和80 nm的球体（PL-FA）表现最好，而且它们走的是完全不同的路子——立方体主要靠网格蛋白介导的内吞和特定的膜曲率感应蛋白进入细胞，而球体则通过吸附特殊的蛋白冠来延长血液循环时间，间接提高肿瘤积累。把筛选出的CL-FA装上靶向线粒体ATP6基因的siRNA，再联合温和的光热治疗（42-48°C），单次治疗就让肿瘤缩小了99%，部分小鼠肿瘤完全消失。更意外的是，CL-FA还被肿瘤相关巨噬细胞大量吞进去，把免疫抑制的M2型巨噬细胞往促炎的M1型那边掰，相当于一边杀肿瘤一边调免疫。这套高通量筛选方法比传统做法节省了30倍的小鼠用量，而且皮下瘤和原位瘤的结果高度一致，左右乳腺肿瘤也没有差异，为精准筛选亚细胞靶向的纳米药物提供了一个很实用的平台。

参考文献：