【摘要】
血小板从循环中渗入肿瘤微环境，促进转移，并赋予几种癌症对化疗的抵抗力。因此，用有效且无毒的抗血小板药物联合抗癌药物来阻止肿瘤-血小板串扰可能是一种有效的癌症治疗策略。为了测试这个概念，德克萨斯农工大学Abhishek Jain教授团队创建了一个卵巢肿瘤微环境芯片 (OTME-Chip)，它由一个血小板灌注的肿瘤微环境组成，它概括了血小板外渗及其后果。
通过包括基因编辑的肿瘤和 RNA 测序，这种芯片上的器官揭示了血小板和肿瘤在剪切作用下通过糖蛋白 VI (GPVI) 和肿瘤半乳糖凝集素-3 相互作用。最后，作为临床试验原理的证明，团队表明 GPVI 抑制剂 Revacept 会损害转移潜能并改善化疗。由于 GPVI 是一种不会损害止血的抗血栓形成靶点，因此它代表了一种安全的癌症治疗方法。团队建议可以部署 OTME-Chip 来研究癌症中的其他血管和血液学靶点。相关论文以题为Human tumor microenvironment chip evaluates the consequences of platelet extravasation and combinatorial antitumor-antiplatelet therapy in ovarian cancer发表在《Science Advance》上。
【图文解析】
OTME-Chip的形成团队受到启发设计了一个器官芯片微流体平台，作为肿瘤微环境的 3D 器官模拟体外模型，与血管和血小板流动相连接（图 1A）。保留了他们最近发布的 OvCa-Chip 现有平台的一些元素，这是一种双腔器官芯片技术，由与 3D 内皮血管共培养的癌细胞组成，由基质涂层的聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 膜隔开。详情参见材料和方法）——但为了能够对癌症进展进行纵向研究并分析外渗血小板对癌细胞增殖和侵袭性的影响，我们通过添加两个相邻的 ECM 室，完全重新设计了设备的顶部肿瘤室，由一个侧面的 PDMS 微柱阵列（图 1B）。
图1 OTME-Chip的微工程。
这种生物系统设计策略，现在称为 OTME-Chip，受到不同的器官芯片技术的启发，该技术通过人工创建的 ECM 模拟材料模拟结直肠癌细胞和乳腺癌细胞的转移侵袭性。这种设计不允许血液灌注或对癌细胞、血管细胞和血液成分之间的相互作用进行密切分析。然而，在 OTME-Chip 中，OvCa-Chip 与这种支柱结构设计的融合为团队提供了第一个机会来研究流动下的关键血小板-癌细胞相互作用，同时仍然保持该技术相对简单且易于适应。首先，团队通过注射由 I 型胶原蛋白制成的预凝胶溶液建立 ECM 隔室，并孵育芯片以形成受微柱限制的半固体水凝胶。接下来，用人卵巢微血管内皮细胞 (HOMECs) 接种装置的下腔室，以形成完整的 3D 血管腔。
血小板在剪切作用下通过 GPVI 与 galectin-3 的结合与癌细胞相互作用在包括卵巢癌在内的几种癌症中，半乳糖凝集素的表达上调并诱导血小板粘附和过度活跃。粘附和活化的血小板反过来又为癌细胞转移做好准备。肿瘤半乳糖凝集素-3 特别包含一个胶原样结构域。另一方面，血小板上的胶原受体 GPVI 在剪切作用下调节血小板活化。因此，团队检查了 OTME-Chip 是否可以揭示 GPVI-galectin-3 结合血小板-癌细胞相互作用的贡献及其在剪切下的转移后果（图 2A）。团队首先检查了在癌细胞暴露于外渗血小板的 72 小时时间轴过程中 galectin-3 的表达和活性，发现 galectin-3 表达是保守的并且不随时间变化（图 2B）。
图 2 血小板 GPVI 表达是剪切依赖性的，它与 OTME-Chip 中的肿瘤 galectin-3 结合。
使用 OTME-Chip 评估 GPVI 和 galectin-3 相互作用在卵巢癌中的后果然后研究了 GPVI-galectin-3 相互作用可能作为血小板促进的卵巢癌肿瘤转移的介质的可能性。为了验证这一假设，团队使用 CRISPR-Cas9 编辑方法建立了半乳糖凝集素 3 敲除 (KO-g3) 的卵巢癌细胞系（图 3A）。比较了由原始卵巢癌细胞 (OTME-Chip) 或半乳糖凝集素 3 敲除的癌细胞 (KO) 组成的 OTME-Chip 中控制癌细胞转移的参数（ECM 侵袭、增殖、细胞因子谱和转录读数）。发现当与外渗血小板 (OTME-Chip) 相对于没有血小板的对照 (Control-Chip) 共培养时，野生型卵巢癌细胞会快速侵入水凝胶 ECM。然而，观察到在存在外渗血小板的情况下，KO-OTME-Chips 中的 ECM 侵入减少（图 3，B 和 C）。在血小板外渗和肿瘤相互作用的 40 至 72 小时内，OTME-Chips 中的癌细胞增殖相对于对照增加，并且在 galectin-3 KO-OTME-Chips 中发现增殖减少（图 3D）。观察到这种 OvCa 细胞增殖与观察时间线内的 ECM 水凝胶侵入成正比。
图3 血小板GPVI通过在OTME-Chip中与癌细胞结合的galectin-3促进卵巢转移。
OTME-Chip 预测 GPVI 的药物抑制可阻止转移并支持化疗团队发现 Revacept 处理的 OTME-Chips (Rx-OTME-Chips) 表现出显着降低的 GPVI-galectin-3 结合动力学（图 4A）。Revacept 显着降低了癌细胞的 ECM 侵袭和增殖率，表明 GPVI 抑制也阻止了 GPVI-半乳糖凝集素-3 相互作用的后果（图 4，B 到 D）。
图 4 Revacept（GPVI 抑制剂）阻止 OTME-Chip 中的卵巢转移。
此外，由于血小板已被证明可促进肿瘤化学抗性，团队检查了 GPVI-galectin-3 相互作用的影响，并通过 Revacept 阻断这种相互作用对卵巢癌细胞的化学抗性。使用无药物 (OTME-Chip) 或单独使用接近临床相关浓度 (6 μg/ml) 的抗癌药物顺铂 (Cx-OTME-Chip) 或与 Revacept 复合的顺铂 (CxRx-OTME-Chip) 治疗我们的 OTME-芯片.我们发现单独使用顺铂具有适度的效果，而顺铂-Revacept 组合在降低肿瘤侵袭性（图 5A）、细胞增殖（图 5B）、G2-M 期（图 5C）和浓度方面具有显着效果生长因子和细胞因子（图 5D）。最后，从芯片中获得的癌细胞的转录分析表明，当 OTME-Chip (Cx-OTME-Chip) 中单独包含顺铂时，血小板引发转移和细胞增殖基因的上调，随着时间的推移适度改变；然而，Revacept 显着减弱了这种过度表达（CxRx-OTME-Chip；图 5E）。
图 5 Revacept（GPVI 抑制剂）降低了 OTME-Chip 中的化学抗性。
使用下一代 RNA-seq 验证 OTME-Chip 中的癌细胞-血小板-药物串扰器官芯片技术与 RNA-seq 分析的合作是验证临床前研究和得出公正临床预测的有力工具。因此，为了巩固团队对血小板-肿瘤信号传导关系和 Revacept 治疗效果的见解，通过 RNA-seq 对不同芯片衍生的肿瘤进行了转录组分析（图 6A）。通过 RNA-seq 和差异基因分析，检测到 12,452 个基因在 OTME-Chip 中相对于 Control-Chip 的表达。类似地，相对于 Control-Chip，团队分别检测到 Cx-OTME-Chip、CxRx-OTME-Chip 和 KO-OTME-Chip 中 5566、6909 和 3821 个基因的表达（图 6B）。
图 6 RNA-seq 和差异基因表达分析揭示了抗血小板治疗减弱肿瘤促进途径的功效。
【总结】
团队证明了肿瘤和血小板之间的复杂相互作用以及由此产生的转移过程可以在芯片上具有血管成分的生物工程肿瘤微环境中建模。团队发现该平台可用于识别复杂的肿瘤-血细胞相互作用、转移信号，以及通过整合基因组和蛋白质组学方法评估药物。此外，所需抗癌或抗血小板药物单独或组合的应用范围也使我们的设备成为进行针对血小板引发的癌症转移和化学抗性的药物评估研究的潜在平台。在芯片中包含 ECM 的机会还增加了研究组织侵袭性和不同条件下血小板引起的肿瘤侵袭行为的额外能力。我们预计，通过整合源自恶性肿瘤的诱导多能干细胞和其他患者来源的血液或免疫细胞，这种 OTME-Chip 技术可以进一步推进个性化癌症医学，在那里我们可以剖析潜在转移的相互作用信号。总之，人类 OTME-Chip 模型可能为研究血细胞与癌细胞之间的相互作用、获取功能读数以及不同抗转移药物的临床前数据提供一个潜在平台，然后再开始大型动物研究和人体临床试验。
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